Chromatografie

Preparativní LC

Úlohy preparativních a analytických HPLC systémů se od sebe liší. Zatímco úkolem analytické HPLC je kvalitativní a kvantitativní stanovení definovaných sloučenin ve vzorcích, úkolem preparativní HPLC je separace, vyčištění a izolace cenných produktů ze směsí.

Preparativní chromatografii lze rozdělit do třech základních oblastí:

• Flash chromatografie
• Semi-preparativní separace
• Vsádková preparativní chromatografie (poloprovozní nebo výrobní)
• "True Counter-current chromatography"
• "Simulated moving bed" (SMB)
• Kontinuální chromatografie

Definice rozsahu

Jak pracuje trojitý kvadrupól?

Princip trojnásobného kvadrupólu (TQ) je vysvětlený na systému EVOQ™ firmy Bruker. Klíčové prvky systému jsou zde:

• Axiální intový zdroj
• Aktivní zaostření iontů v Q1
• Iontová dráha bez iontové optiky
• Kolizní cela s geometrií 180°
• Eliptický design
• Detektor umístěný mimo osu Q3

Reagencie pro UHPLC

UHPLC přístroje vyžadují rozpouštědla a chemikálie mnohem vyšší čistoty, než rozpouštědla, která jsou v současné době na trhu. ULC/MS rozpouštědla, pufry a modifikátory (Biosolve) mají maximální čistotu, jakoutato instrumentace vyžaduje:

• velmi nízký posun UV signálu při gradientní eluci
• minimální obsah nečistot
• nejnižší pozadí (obsah iontů) v MS detektorech
• méně než 100 ppb alkalických kovů

Rozpouštědla pro ULC/MS jsou filtrována přes mikrofiltr 0,1 µm, mají odparek max. 1 ppm a jsou balena v inertní atmosféře, čímž je zajištěna jejich delší stabilita při skladování. Kromě standardního 2,5 l balení Biosolve nabízí i reagencie pro nano LC/MS:

• 500 ml balení acetonitrilu, metanolu a isopropanolu
• 1 l balení ultra-čisté vody
• 100 ml TFA

Další informace o dodávaných reagenciích si vyžádejte u našich zástupců nebo kanceláří.

Čištění injektoru

INJEKTOR

• Udává se, že příčinu 85-90% problémů při analýze lze najít v inletu. Proto nezapomínejte pravidelně vyměňovat veškerý spotřební materiál. Liner, septum i veškerá těsnění mají omezenou životnost!
• Někdy však výměna spotřebního materiálu ani zaříznutí kolony nestačí. Pak je nutné vyčistit přívod. Obecné pokyny naleznete níže, ale vždy se řiďte pokyny především svého výrobce!

Čištění

• Vstup zchlaďte. Teplota by neměla přesahovat 40°C.
• Vypněte průtok nosného plynu.
• Deinstalujte případný autosampler.
• Deinstalujte kolonu.
• Otevřete přívod, vyberte veškerý spotřební materiál.
• Pokud lze, je vhodnější odpojit splitovou větev pneumatického systému od inletu.
• Inlet nyní sestává pouze z kovové trubky, která může a nemusí být na konci zúžená.
• Existují různé nástroje, které lze použít k čištění (např. Restek). Pomocí takového kartáče a methylenchloridu a methanolu pohyby dolů a vyčistěte přívod.
• Pomocí pipety prostříkněte vstup rozpouštědlem (rozpouštědlo pod vstupem zachyťte do kádinky) a jednoznačně se, že ve vstupu nezůstaly žádné částice nečistoty.
• Pro odstranění zbytků vložte nahřejte přívod na cca 65 °C.
• Reinstalujte splitovou větev pneumatického systému, nainstalujte nový spotřební materiál.
• Zapněte průtok nosného plynu. Zkontrolujte těsnost.
• Před zvýšením teploty nechte přívod alespoň 10 minut proplachovat. Odstraňte zbytky kyslíku. Předčasným zvýšením teploty může dojít k aktivaci a znehodnocení nového spotřebního materiálu.

Čištění detektoru

FID

Výrazný šum, náhodné ghost píky, malá citlivost. To jsou typické znaky špinavého FID detektoru.

Nejčastější příčinou kontaminace FIDu je krvácení z kolony. Spálená stacionární fáze se může usazovat na povrchu trysky detektoru a způsobovat problémy. Na trysku se však napalují i další kontaminanty.

Je potřeba vyčistit Váš detektor?

Výše popsané problémy ovšem nemusejí být způsobeny jen kontaminací detektoru. Níže popsané kroky Vám pomohou vyloučit další potenciální příčiny.

Nosný plyn a krvácení stacionární fáze

Možný zdroj kontaminace lze najít nejen v samotném detektoru, ale i před ním. Krvácení stacionární fáze kolony, septa, kontaminovaný inlet, znečištěný nosný plyn... K vyloučení tohoto zdroje zaslepte vstup FIDu odpovídající záslepkou a zapněte FID. Pokud problémy ustanou, hledejte problém mimo detektor. Není potřeba vyměnit liner? Septum? Vyčistit inlet? V jakém stavu je kolona? Máte čistý nosný plyn? Nemáte v systému netěsnost?

Vodík a vzduch

I vodík a vzduch použité ve FIDu mohou být zdrojem kontaminace. Zpozorněte zejména pokud se problémy objevily po výměně tlakové lahve.

Také nesprávný průtok/tlak těchto dvou plynů může být zdrojem zvýšeného šumu, snížené citlivosti a problémů při zapalování FIDu. Zkontrolujte průtoky pomocí průtokoměru.

Elektrický systém

I elektrické rušení může vykazovat podobné symptomy jako špinavý FID. Může se jednat o vadu elektrometru, špatný kontakt či rušení dalšími přístroji v laboratoři.

Než začnete čistit

• Nezapomeňte odpojit napájecí kabel!
• Pamatujte, že detektor může být horký!
• Při rozebírání FIDu věnujte pozornost izolačním částem. Používejte pinzetu, ať na tyto části nepřenesete nečistoty z rukou, či rukavic. Pozor na možné poškrábání.
• Pamatujte, že někdy může být jednodušší trysku vyměnit než ji čistit. Platí to zejména v případě, že je tryska těžce kontaminována a prudce se zvyšuje riziko poškrábání trysky při čištění.

Čištění

• Vyjměte trysku z FIDu.
• Vložte ji do ultrazvukové lázně s vodou a detergentem a ultrazvukujte cca 5-10min.
• Pomocí příslušného nástroje nebo vhodného tenkého drátu pročistěte trysku. Buďte pozorní. Případné poškrábání může vést ke změně tvaru plamene, zvýšení šumu či ztrátě citlivosti.
• Trysku opět vložte do ultrazvukové lázně a ultrazvukujte dalších 5-10min. Od této chvíle už pro manipulaci s tryskou používejte pouze pinzetu.
• Propláchněte trysku čistou vodou.
• Propláchněte trysku malým množstvím metanolu.
• Profoukněte trysku proudem vzduchu nebo dusíku.
• Nechte trysku uschnout.
• Seskládejte FID. Věnujte pozornost dotahování. Při přetažení trysky může dojít k její deformaci!
• Po seskládání můžete připojit kolonu. Je vhodné vyhřát FID na teplotu o 10°C-40°C vyšší než je obvyklá provozní teplota detektoru. Pozor na maximální teplotní limit FIDu! Pozor na maximální operační teplotu kolony!

Jak udržet Váš detektor FIT

• Nová kolona krvácí nejvíce. Instalujte kolonu do inletu jako obvykle, detektorový konec však nechte volně v peci a kondicionujte kolonu. Po té nainstalujte kolonu do detektoru.
• Používejte kvalitní kolony s nízkým krvácením.
• Vlhkost a kyslík v nosném plynu poškozují stacionární fázi kolony a způsobují její krvácení. Požívejte vysoce čisté plyny, molekulová síta, trapy... Kontrolujte těsnost plynového okruhu.
• Používejte vhodná septa s nízkou krvácivostí a měňte je dostatečně často.

ECD

ECD je specifický a citlivý detektor. Nevhodným chováním však můžete prudce snižovat jeho životnost. Postupné zvyšování signálu je u tohoto detektoru normální. Pokud ale zvýšení nastane skokově nebo se přidá další ze symptomů-zhoršení šumu, snížení citlivosti, hledejte problém.

Čištění

• ECD obsahuje radioaktivní materiál, proto jsou nařízené pravidelné otěrové testy. Je zakázáno ho otvírat a jakkoliv do něj zasahovat.
• ECD lze čistit jedině termicky. Obecně čištění probíhá tak, že se ECD detektor vyhřeje na teplotu blízkou své maximální operační teplotě a nečistoty se vypálí. Před čištěním se ujistěte, že v systému nejsou netěsnosti. Navyšování teploty probíhá postupně. Sledujte signál. Zvyšujte teplotu o 10-20 °C, signál začne růst. Počkejte až se signál ustálí a začne klesat, pak můžete opět zvýšit teplotu. Po dosáhnutí požadované teploty, čekejte na pokles signálu k očekávaným hodnotám.
• Řiďte se návodem Vašeho výrobce, postup se může lišit.
• Pokud zahříváte detektor s instalovanou kolonou nepřekračujte maximální operační teplotu kolony, případně kolonu deinstalujte z detektoru a nahraďte záslepkou.

Neničte svůj detektor!

• Používejte kvalitní plyny, určené pro ECD.
• Používejte molekulová síta, trapy na dočištění plynů.
• Při potížích- zvýšení signálu, zhoršení šumu, snížení citlivosti apod. kontrolujte těsnost systému.
• Používejte kvalitní kolony a septa s nízkým krvácením.

Volba hrotu stříkačky

Volba hrotu stříkačky záleží na tom, pro jakou aplikaci chcete stříkačku použít. Níže uvedený obrázek vám pomůže s výběrem správného hrotu.

Technologie GC/MS TOF

Proč zvolit techniku Fast GC/MS?

Požadavky laboratoří neustále narůstají a jejich zájmem jsou především:

• rychlé analýzy (vyšší kapacita a tedy efektivita & nižší náklady na analýzu)
• nízké detekční limity (díky požadavkům nových metod)
• vysoká kvalita dat spojená s čím dál tím složitějšími matricemi

Multidimenzionální (komprehensivní) GC, tedy GCxGC/MS má obrovské výhody právě u komplexních vzorků, kde standardní kvadrupólové systémy selhávají jednak svou rychlostí, jednak i svým omezením v oblasti citlivosti v plném rozsahu m/z. Mnoho reálných vzorků v praci již prokázalo, že při kontrolních analýzách prostřednictvím GCxGC/MS v nich byly odhaleny další sloučeniny, které nebyli identifikovány a standardní GC/MS technika vedla k mylné interpretaci.

Popis GC/MS-TOF

TOF vs. kvadrupólový analyzátor

GC závady a jejich odstranění

Prevence

Mnoha problémům s GC lze předejít správnou instalací kolony a preventivní údržbou. Potížím lze předejít zejména pravidelnou výměnou septa a lineru a údržbou injektoru a detektoru. Požadavky na pravidelnou preventivní údržbu se liší dle modelu Vašeho GC, pokyny pro její správné provedení lze najít v operačním a servisním manuálu.

Pro identifikaci možných problémů doporučujeme užití elektronického průtokoměru a detektoru netěsností (Leak detektor).

Problémy se základní linií (baseline)

Problémy s baseline mohou být rozděleny do pěti kategorií:drift, šum, offset, spikování a vlnění.

• Drift -pomalý posun baseline v jednom směru
• Šum-(noise) častá, nahodilá změna výšky baseline
• Offset (posun) - náhlá nevysvětlitelná změna výšky baseline
• Spikování -výskyt velmi úzkých píků pozitivních i negativních
• Vlnění baseline (wander) -šum o nízké frekvenci

Drift - klesající signál

Drift - rostoucí signál

Šum

Offset

Spikování

Vlnění baseline

Zkreslené tvary píků

Redukovaná plocha všech píků

Seřízlé vrcholy píků

Frontující pík

Frontující pík je většinou výsledek přehlcení kolony. Nařeďte vzorek, snižte nastřikované množství nebo použijte kolonu s vyšší kapacitou. Vyšší kapacitu mají kolony se širším průměrem a větší vrstvou stacionární fáze, může být ovšem sníženo rozlišení.

Ghost píky (falešné píky)

Nereprodukovatelná plocha nebo výška píku.

Negativní píky

Žádné píky

Selektivní ztráta citlivosti

Rozštěpené píky

Chvostující píky

Posun retenčních časů

Ztráta rozlišení

Široký rozpouštědlový pík

Rychlá degradace kolony

Instalace kolony

Detailní informace o instalaci GC kolony jsou k dispozici zde.

Preventivní údržba

Čištění injektoru

Čištění detektoru

TOF vs. kvadrupól

V tomto článku vám ukážeme, proč je GC/MS-TOF vhodnější technikou při moderních GC/MS analýzách než několik desetiletí stará technologie využívající kvadrupólový analyzátor.

1) Proč TOF poskytuje kvalitnější data?

Vyšší rychlost GC/MS systému Time of Flight znamená vyšší počet spekter na chromatografický pík. Analytik má tedy k dispozici více dat a může díky unikátnímu algoritmu dekonvoluce identifikovat sloučeniny, které mají podobné vlastnosti (izomery apod.), kdy nám rozlišení hmotnostním spektrem na jednotkové úrovni nestačí.

TOF může pracovat s analýzou MS spektra v celém rozsahu m/z – díky dobré citlivosti není potřeba používat SIM režim a tedy analytik neztrácí kvalitativní informace o struktuře sloučeniny. To může hrát velkou roli při mezilaboratorní kontrole nebo v případech, kdy jsou rozdílné výsledky mezi laboratořemi.

2) Vyšší citlivost

Time off Flight není skenovací analyzátor, nýbrž pulzní. Díky vysoké expulzní rychlosti 30kHz umožňuje sběr spekter až 1000/s, což kvadrupólový analyzátor nemůže dosáhnout. Navíc kvadrupól se po jednom skenu musí vrátit na původní hodnotu elektrického pole, což zabírá další čas, tzv. “Interscan time”. To významně prodlužuje průměrnou dobu jednoho skenu. Např. bude-li prováděna analýza PBDE v rozsahu 100-1000 amu, GC/MS systém se skenovací rychlostí 20000 amu/s, dosáhneme rychlost sběru dat <20spekter/s. U analyzátoru TOF dosáhneme jednoduše 200 spekter/s, tedy 10x vice. Vyšší rychlost umožňuje nejen Fast GC/MS, ale kvalitnější data. Fast GC/MS poskytuje vyšší píky, tedy lepší poměr signál/šum. Navíc, u analýzy sloučenin, jako např. PBDE je nutné analyzovat celá hmotnostní spektra a u jvadrupólového analyzátoru tím velmi ztrácíme v EI cistlivost.

3) Ekonomika provozu

Při použití GC/MS-TOF dosáhneme vysoké rychlosti sběru spekter, takže můžeme při použití vhodné kolony (0,10 nebo 0,18 mm ID) zkrátit analýzu 3x až 4x. Tím významně ušetříme na provozním času přístroje, spotřebě nosného plynu a zvýšíme průchodnost vzorků. To může nejen zvýšit kapacitu laboratoře, ale zrychlit dodání výsledků analýzy.

Linery pro GC

Pro většinu chromatografistů je při vývoji metod důležitá opakovatelnost nástřiku vzorku a kvalitní přenos vzorku z injektoru na chromatografickou kolonu. jedním z parametrů, který má velký vliv na opakovatelnost a kvalitu přenosu vzorku na chromatografickou kolonu je typ GC lineru. Ten ovlivňuje stabilitu látek při vysoké teplotě a kvalitu odpařování a přenosu hmoty. Proto je výběr GC lineru velmi důležitý a velice záleží na použité nástřikové technice. Zde najdete důležité informace, které vám pomohou při výběru správného GC lineru.

Deaktivace Siltek

Důležité informace k injektorům

Nový design linerů - FocusLiner™

Průvodce výběrem linerů SGE

Inertní linery TOPAZ™ (Restek)