0 Porovnat
Přidejte si do porovnání produkty pomocí ikonky vah a zde si poté můžete porovnat jejich parametry.
Uživatel
0 Košík
Váš košík je prázdný...

Chromatografie

Úvod

Aminokyseliny jsou klíčovými stavebními kameny života a hrají klíčovou roli v různých metabolických drahách. Vzhledem k jejich chemické složitosti a dynamickému rozsahu je jejich spolehlivá kvantitativní a kvalitativní analýza v biologických tekutinách a tkáních zásadní pro nutriční informace, identifikaci sloučenin a diagnostiku.

Za tímto účelem byla vyvinuta jednoduchá, elegantní a dosud nejrychlejší metoda pro analýzu aminokyselin. Kit MetAmino® na bázi LC/GC-MS nabízí komplexní řešení pro 75 metabolitů včetně základních proteinogenních aminokyselin, biogenních aminů a koenzymů s možností dalšího rozšíření analytů.

Chromatogramy

Obr. 1: Chromatogram vnitřních standardů, SD1 a SD2. Separace 5 nmol aminokyselin pomocí LC-MS MetAmino®

Obr. 2: Chromatogram reálného vzorku: Separace aminokyselin ve vzorku piva Budvar 12˚ (25 µl vzorku bylo nastříknuto na kolonu). Vysoká účinnost naší kolony a vysoké rozlišení přispívají k pěkné separaci píků. Vzorek testován pomocí LC-MS MetAmino®

Obr. 3: Chromatogram reálného vzorku: Separace aminokyselin přítomných v krevním séru (25 µL vysráženého séra bylo nastříknuto na kolonu). Vysoká účinnost naší kolony a vysoké rozlišení přispívají k pěkné separaci píků. Vzorek testován pomocí LC-MS MetAmino®

Příprava vzorků

Níže je uvedený stručný postup přípravy vzorku. Podrobný postup naleznete v uživatelské příručce MetAmino®.

Příprava vzorku pro LC-MS analýzu probíhá následovně:

  1. Napipetujte 100 μl vašeho vzorku (sérum, plazma, ...) do centrifugační zkumavky a přidejte 100 μL precipitačního média. Centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
  2. Napipetujte 25 μl vašeho vysráženého vzorku do nové centrifugační zkumavky a přidejte 10 μl roztoku s vnitřními standardy.
  3. Napipetujte 20 μl katalytického roztoku a 5-10 sekund vortexujte.
  4. Napipetujte 10 μl reagenčního (derivatizačního) činidla a vortexujte 5-10 sekund. Nechte derivatizaci probíhat alespoň 2-3 minuty.
  5. Aktivujte a ekvilibrujte sorbent v MSPE filtru přidáním:
    1. 200 μl aktivačního média sorbentu MSPE, poté centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
    2. 200 μl ekvilibračního média sorbentu MSPE, poté centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
  6. Vylijte eluát prošlý membránou.
  7. Derivatizační reakční směs nařeďte 400 μl ředícího a promývacího média a vortexujte 5-10 sekund.
  8. Zředěnou reakční směs (typicky 450-500 μl) napipetujte na aktivovaný a naekvilibrovaný MSPE filtr a nechte 1-2 minuty stát. Centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
  9. Vylijte eluát prošlý membránou.
  10. Promyjte sorbent v MSPE filtru 200 μl ředícího a promývacího média a centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
  11. Umístěte MSPE filtr do nové centrifugační zkumavky, přidejte 200 μl elučního média a centrifugujte 30 až 60 sekund při 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
  12. Přeneste eluát do nové vialky a umýstěte jej do autosampleru. Vzorek je připraven pro LC-MS analýzu.

Příprava vzorku pro GC-MS analýzu probíhá následovně:

  1. Do reakční skleněné zkumavky napipetujte 25 μl vzorku a 10 μl roztoku s vnitřními standardy.
  2. Do reakční skleněné zkumavky napipetujte 20 μl redukčního činidla a krátce, 5 až 10 sekund, vortexujte. Nechte 1 až 2 minuty odstát.
  3. Do reakční skleněné zkumavky napipetujte 25 μl základního roztoku.
  4. Potom přidejte 50 μl reagenčního (derivatizačního) činidla a vortexujte 5 až 10 sekund.
  5. Napipetujte 25 μl katalytického roztoku do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte.
  6. Znovu napipetujte 25 μl katalytického roztoku do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte. Nechte 1-2 minuty odstát. Emulze se postupně rozdělí na dvě vrstvy.
  7. Napipetujte 50 μl extrakčního média do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte.
  8. Napipetujte 25 μl kyselého média do reakční skleněné zkumavky a 5 až 10 sekund vortexujte. Poté centrifugujte 30 až 60 sekund 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
  9. Přeneste organickou (horní) vrstvu (50-100 µL) do autosamplerové vialky s insertem. Vzorek je připraven pro analýzu GC-MS.

Obsah sady

MetAmino® kit obsahuje všechna činidla, média a chemikálie. Obsah startovací sady je uveden v tabulkách níže:

Obsah soupravy LC-MS pro 100 vzorků:

Položka Typ vialky Objem
ve vialce
(ml)
Počet
vialek
(100
vzorků)
Standardy aminokyselin SD1 roztok 2 ml vialka 0,25 1
Standardy aminokyselin SD2 v práškové formě 2 ml vialka - 2
Roztok s vnitřními standardy (IS) 2 ml vialka 1,1 1
Aminokyselinové standardní ředící médium (AASDM) 4 ml vialka 1,4 1
Aktivační médium sorbentu MSPE (WES) 40 ml vialka 22 1
Ekvilibrační médium sorbentu MSPE (EQS) 40 ml vialka 22 1
Katalytický roztok (CTS) 4 ml vialka 2,2 1
Reagenční (derivatizační) činidlo (RDS) 4 ml vialka 1,1 1
Ředicí a promývací médium (DWM) 40 ml vialka 33 2
Eluční médium (ELM) 40 ml vialka 22 1
Precipitační médium (PM) 40 ml vialka 11 1
Položka Množství
(100 vzorků)
Poznámka
MetAmino® HPLC kolona 1 ks Speciální stacionární fáze
Stojánek až pro 80 centrifugačních zkumavek 1 ks
Microspin filtry se sorbentem MetAmino® 100 ks Vnitřní kolonka vč. 0,22µm membrány
Centrifugační zkumavky (2 ml) 400 ks
Autosamplerové vialky (9 mm šroubovací uzávěr) 100 ks Včetně sept a víček

Obsah soupravy GC-MS pro 100 vzorků:

Položka Typ vialky Objem
ve vialce
(ml)
Počet vialek
(100 vzorků)
Standardy aminokyselin SD1 (roztok) 2 ml vialka 0,25 1
Standardy aminokyselin SD2 v práškové formě 2 ml vialka - 2
Roztok s vnitřními standardy (IS) 2 ml vialka 1,1 1
Aminokyselinové standardní ředící médium (AASDM) 4 ml vialka 1,4 1
Redukční činidlo (RA) 4 ml vialka 2,75 1
Základní roztok (BM) 4 ml vialka 2,75 1
Katalytický roztok (CTS) 40 ml vialka 5,5 1
Reagenční (derivatizační) činidlo (RDS) 40 ml vialka 5,5 1
Extrakční médium (EM) 40 ml vialka 5,5 1
Kyselé médium (AM) 4 ml vialka 2,75 1
Položka Množství Poznámka
MetAmino® GC kolona 1 ks Speciální stacionární fáze
Reakční skleněné zkumavky 100 ks -
Stojánek až pro 80 reakčních zkumavek
Autosamplerové vialky (9 mm šroubovací uzávěr) 100 ks Včetně sept a víček
Inserty do vialek autosampleru 100 ks -

Vlastnosti

  • V zásadě vhodný pro jakékoli matrice (moč, krevní sérum, slzy, mozková tekutina, tkáňové extrakty, půdní extrakty atd.)
  • Snadná příprava vzorku
  • Derivatizace a analýza vzorků do 20 minut
  • Široké portfolio analytů (75) s možností dalšího rozšíření
  • Není potřeba žádné zahřívání/zmrazování vzorku
  • K dispozici knihovna NIST pro GC/MS
  • Lze určit látky s nízkou molekulovou hmotností, které mohou být degradovány v iontovém zdroji (např. GLY, ALA atd.)
  • Vhodné pro analýzu obtížně kvantifikovatelných látek, jako jsou polyaminy
  • Součástí jsou všechna potřebná činidla, příslušenství, HPLC kolona a návod pro derivatizaci a analýzu s vysokou přesností a citlivostí

Popis

Naše sady MetAmino® LC-MS a GC-MS poskytují rychlou, robustní, reprodukovatelnou a precizní metodu pro analýzu aminokyselin, která zahrnuje jak přípravu vzorků, tak i chromatografickou separaci.

Metoda využívající LC-MS je založena na mikro-extrakci na pevné fázi využívající speciální mikrospin filtry (MSPE) s nově vyvinutým sorbentem a integrovanou membránou 0,22 µm, metoda GC-MS využívá pro přípravu mikroextrakci kapalina-kapalina (LLME). Po této předúpravě je vzorek analyzován v LC-MS (GC-MS). Celkově trvá příprava vzorku pro LC-MS asi 8 minut a analýza vzorku 12 minut, takže celá doba experimentu je pouhých 20 minut. Celková doba experimentu GC-MS je dokonce kratší – zhruba 17 minut.

Tato jedinečná sada splňuje všechny požadavky laboratoří a je navržena pro všechny koncové uživatele, kteří hledají jednoduchou analytickou metodu a vysokou účinnost separace.

MetAmino FAQ

Jaký je typ membrány uvnitř spin filtru?
  • Membrána je vyrobena z materiálu NYLON a její porozita je 0,22 µm. Její průměr je optimalizovaný pro použití s daným spin filtrem.
Je možné rozšířit MetAmino® kit o další analyty?
  • Ano, MetAmino® kit je možné dále rozšiřovat. Kontaktujte nás s detailními informacemi.
Můžu použít MetAmino® kit pro analýzu moči?
  • Ano, MetAmino® kit lze použít pro analýzu moči. Vzorek nesmí obsahovat bílkoviny, takže před použitím kitu musí být upraven běžným způsobem (odstřeďování, filtrace).
Můžeme objednat reagencie samostatně?
  • Ano, celou soupravu reagencií je možné objednat pod katalogovým číslem MAK-5857-L002.
Jaký je tlak v průběhu LC/MS analýzy?
  • Na začátku analýzy je tlak 380 barů, na konci je 200 barů.
Jsou MRM pro aminokyseliny uvedené v MetAmino® kitu vytvořeny po derivatizaci standardů nebo před ní?
  • Přechody MRM pro AA uvedené v návodu jsou uvedeny jako přechody derivátů AA a nikoli nativních AA.
Měl by být vzorek krmiva před prací se soupravou MetAmino® kitu hydrolyzován?
  • Precipitace pomocí precipitačního média (PM) není nezbytným krokem pro úspěšnou derivatizaci vzorku. Kit byl testován především pro analýzu biofluidů, které často obsahují peptidy. Aby se zabránilo jejich srážení během derivatizace, byl krok srážení zahrnut do protokolu přípravy vzorku.
  • Pokud je vyžadována celková analýza volných a na peptid vázaných aminokyselin, v tomto případě bychom doporučili vzorek hydrolyzovat a poté alikvot hydrolyzovaného vzorku vysušit pod proudem dusíku nebo ve speedvacu. Vysušený zbytek rozpusťte ve 25 µl deionizované vody nebo 0,1M vodné HCl (pro lepší rozpustnost) a postupujte podle návodu přidáním 10 µl roztoku IS.
  • Pokud jde o hydrolýzu peptidů, používaná aditiva (fenol, thiodiglykol) v hydrolyzačním médiu by také mohla být derivatizována (pravděpodobně nebudou vidět ve "full scan"). Proto jako hydrolyzační médium doporučujeme 6M HCl.
Můžeme si objednat MetAmino® GC/MS kit pro přípravu 400 vzorků?
  • Zatím ne, v současné době máme pouze MetAmino® GC/MS kit pro přípravu 100 vzorků. Tuto soupravu lze objednat pod katalogovým číslem MAK-5857-BA01.
V tabulce je 78 aminokyselin, z nichž některé nejsou v dostupných mixech standardů – máme se tedy spoléhat na MRM přechody a dívat se na retenční čas nebo jsou to standardy, které bychom si měli koupit, pokud je chceme určovat?
  • Pro účely kvantifikace obsahuje sada MetAmino - jedna lahvička standardního roztoku SD1 obsaženého v sadě obsahuje 33 aminokyselin: AAA, ABA, ALA, APA, ARG, ASP, BAIBA, CC, CIT, CTH, GABA, GLU, GLY, GPR , HIS, HLY, HYP, ILE, LEU, LYS, MET, 1MHIS, 3MHIS, ORN, PHE, PHP, PRO, SAR, SER, THR, TPR, TYR, VAL a lahvička SD2 s lyofilizovanou směsí 3 aminokyselin: ASN, GLN, TRP. Sada aminokyselin však může být dále rozšířena na další sloučeniny obsahující primární nebo sekundární amino funkční skupiny.
  • Hmotnosti (m/z) uvedené v příručce jsou správné a představují ionty M+H+. Hmotnosti (m/z) a retenční časy z manuálu byly získány z přístroje LTQ s lineární iontovou pastí, avšak data z Certifikátu analýzy byla získána z přístroje Q Exactive plus HRMS. V obou případech byla použita stejná kolona, průtok a složení mobilní fáze. Retenční časy (RT) jsou experimentální hodnoty a nesrovnalosti, zejména u sloučenin s pozdní elucí, by byly způsobeny použitím různých LC/MS přístrojů.

Přehled sorbentů MSPE

Sorbenty pro techniku MSPE jsou zvoleny tak, aby pokryly co nejširší pole aplikací. MSPE SpeExtra C18 je hydrofóbní typ oktadecyl silikagelu se speciálním endcappingem s velmi širokým uplatněním. Je vhodný pro celou řadu analytů, horší retenci vykazuje pro polární sloučeniny. MSPE SpeExtra C18-P je polárně modifikovaný monomerní oktadecyl silikagel . Nabízí různé typy interakcí: dipól-dipól, π- π a hydrofóbní. Je tedy vhodný pro aromatické a polární sloučeniny. MSPE SpeExtra HLB polymerní sorbent s vysokým měrným povrchem a speciálním endcapoingem. Má hydrofilní a lipofilní modifikaci zajišťující univerzální použití a vyšší kapacitu než C18 silikagel.

MSPE sorbent Velikost částic [µm] Měrný povrch [m2/g]
C18 60 310
C18-P 60 310
HLB 30 850

Čištění a testování konopí

Konopí obsahuje stovky kanabinoidů, přičemž kanabidiol (CBD) je v rostlině nejrozšířenější a Δ 9-Tetrahydrocannabinol (THC) je aktivní složkou způsobující psychotropní účinky. Existuje však mnohem více sloučenin, které jsou vytvářeny rostlinou konopí a byly zkoumány pro jejich lékařské účinky. Tento limit často vyžaduje úpravu destilovaného konopného extraktu (odstranění THC z výchozího extraktu) a lze ji dosáhnout pomocí preparativní chromatografie, např. pomocí systému puriFlash® XL-Cannabis. HPLC analýza výchozího materiálu (destilátu), frakcí shromážděných během procesu čištění a konečného produktu může být provedena analytickým systémem Advion AVANT HPLC-UV. Jak čištění, tak analytické metody jsou uvedeny v této božuře a tvoří kompletní řešení pro odstranění THC v konopném průmyslu.

  • přístroj puriFlah® L-Canabis s výkonem až 4,3 kg/den (kolony do 15 cm ID)
  • nástroj puriFlah® XL-Canabis s výkonem až 12,2 kg/den (kolony do 20 cm ID)
  • Plate Express TLC čtečka destiček

Fáze pro SPE

SPE kolonky

Na této stránce uvádíme přehled nabízených kolonek pro extrakci na pevné fázi (SPE) včetně technických parametrů. Další informace k produktům najdete v katalogu zboží, ve kterém jsou uvedeny SPE kolonky a disky, dSPE produkty, manifoldy, produkty pro on-line SPE a vakuová čerpadla.

Clean up SPE kolonky

Reverzní fáze hydrofobní

Phase Particle size (µm) Pore Size (A) Surface Area (m2/g) Carbon Load (%) End Capping Feature
C2 Ethyl 60 500 6,6 YES/NO
C4 n-Butyl 60 500 8,5 YES
C8 Octyl 60 500 11,1 YES/NO
C18 Octadecyl 60 500 21,7 YES/NO
C30 Tricontyl 60 500 20,0 YES
Cyclohexyl 60 500 11,6 YES/NO
Phenyl 60 500 11,0 YES/NO

Normální fáze hydrofilní

Phase Particle size (µm) Pore Size (A) Surface Area (m2/g) Carbon Load (%) Feature
Silica 0,77 60 500 N/A
Diol 0,77 60 500 8,0
Cyanopropyl 0,77 60 500 9,0
Florisil 0,82 60 500 N/A
Alumina, Acidic 60 500 N/A
Alumina, Basic 60 500 N/A
Alumina, Neutral 60 500 N/A
Carbon N/A 120/140 mesh

Ion Anion Exchange fáze

Phase Pore volume (cm3/g) pKa Pore Size (A) Surface Area (m2/g) Carbon Load (%) Exchange (meq/g)
Aminopropyl (1 amine) 0,77 9.8 60 500 6,65 0,31
N-2 Aminoethyl (1/2 amine) 0,77 10.1; 10.9 60 500 11,1 0,32
Diethylamino (3 amine) 0,77 10.6 60 500 10,6 0,28
Quarternary Amine Chloride 0.77 Always charged 60 500 8,4 0,25
Quarternary Amine Hydroxide 0.77 Always charged 60 500 8,4 0,25
Quarternary Amine Acetate 0.77 Always charged 60 500 8,4 0,25
Quarternary Amine Formate 0.77 Always charged 60 500 8,4 0,25
Polyimine 0,77 Always charged 13,5 0,25

Ion Cation Exchange fáze

Phase Pore volume (cm3/g) pKa Pore Size (A) Surface Area (m2/g) Carbon Load (%) Exchange (meq/g)
Carboxylic Acid 0.77 4.8 60 500 9,2 0,17
Propylsulfonic Acid 0.77 1 60 500 7,1 0,18
Benzenesulfonic Acid 0.77 Always charged 60 500 11,0 0,32
Benzenesulfonic Acid, High Load 0.77 Always charged 60 500 15,0 0,65
Triacetic Acid 0,77 60 500 7,61 Anion 0,17/Cation 0,06

Kopolymerní fáze

Phase Pore volume (cm3/g) pKa Pore Size (A) Surface Area (m2/g) Carbon Load (%) Exchange (meq/g)
Aminopropyl + C8 0.77 9,8 60 500 12,3 0,163
Quarternary Amine + C8 0.77 Always charged 60 500 13,6 0,160
Carboxylic Acid + C8 0.77 4,8 60 500 2,5 0,105
Propylsulfonic Acid + C8 0.77 1 60 500 14,62 0,114
Benzenesulfonic Acid + C8 0,77 Always charged 60 500 12.3 0,072
Cyanopropyl + C8 0,77 N/A 60 500 14,6 0,163
Cyclohexyl + C8 0.77 N/A 60 500 N/A N/A