Chromatografie / CHROMSERVIS.EU

Vlastnosti rozpouštědel

Solventní	Index polarity	Index lomu (20°C)	UV (nm) cutoff (1 AU)	Bod varu (°C)	Viskozita (mPa.s; 20 °C)	Mísitelnost s vodou
Octová kyselina	6.2	1,372	230	118	1,26	100
Aceton	5.1	1,359	330	56	0,32	100
Acetonitril	5.8	1,344	190	82	0,37	100
Benzen	2.7	1 501	280	80	0,65	0,18
Butylacetát	4.0	1 094	254	125	0,73	0,43
n-butanol	3.9	1,399	215	118	2,98	7,81
Tetrachlorid uhličitý	1.6	1,466	263	77	0,97	0,08
Chloroform	4.1	1,466	245	61	0,57	0,815
Cyklohexan	0,2	1,426	200	81	1,00	0,01
Ethylenchlorid	3.5	1,444	225	84	0,79	0,81
Methylenchlorid	3.1	1,424	235	41	0,44	1,6
Dimethylformamid	6.4	1,431	268	155	0,92	100
Dimethylsulfoxid	7.2	1,478	268	189	2,00	100
Dioxan	4.8	1,422	215	101	1,54	100
Ethylacetát	4.4	1,372	260	77	0,45	8,7
Ethanol	5.2	1,360	210	78	1,20	100
Diethylether	2.8	1,353	220	35	0,32	6,89
Heptan	0,0	1,387	200	98	0,39	0,0003
Hexan	0,0	1,375	200	69	0,33	0,001
Methanol	5.1	1,329	205	65	0,60	100
Methylbutylether	2.5	1,369	210	55	0,27	4,8
Methylethylketon	4.7	1,379	329	80	0,45	24
Pentan	0,0	1,358	200	36	0,23	0,004
n-Propanol	4.0	1,384	210	97	2,27	100
isoPropanol	3.9	1,377	210	82	2,30	100
Diisopropylether	2.2	1,368	220	68	0,37
Tetrahydrofuran	4.0	1,407	215	65	0,55	100
Toluen	2.4	1,496	285	111	0,59	0,051
Trichlorethylen	1,0	1,477	273	87	0,57	0,11
Voda	9,0	1,333	200	100	1,00	100
Xylen	2.5	1 500	290	139	0,61	0,018

Závislost viskozity směsi rozpouštědel na jejím procentuálním složení

% z vody	Viskozita (MeOH/voda)	Viskozita (ACN/voda)
0	0,65	0,35
10	0,95	0,50
20	1,20	0,55
30	1,60	0,70
40	1,75	0,80
50	1,90	0,90
60	1,80	1,00
70	1,75	1,05
80	1,65	1,10
90	1,40	1,05
100	1,00	1,00

Graf

Odhad tlaku na HPLC kolonách v závislosti na velikosti částic, průměru a délce kolony

Velikost částic (µm)	ID (mm)	Průtok (ml/min)	Tlak *150 mm (PSI)**	Tlak *250 mm (PSI)**
3	4,6	0,5 – 1,0	1000	1500
5	3,0	0,4 – 0,8	750	1250
5	4,6	1,0 - 2,0	700	1100
5	10,0	5,0 – 10,0	750	1250
10	4,6	2,0 – 5,0	400	600
10	10,0	10,0 – 20,0	500	800
10	21,2	20,0 – 40,0	300	500

* Při průtoku na dolních hranicích doporučených průtoků

Volba kapilár pro různé průtoky

ID	Průtok	Barva	OD
0,13 mm	Až 2,0 ml/min	Červené	1/16"
0,18 mm	Až 5,0 ml/min	Žlutá	1/16"
0,25 mm	Až 20 ml/min	Modrý	1/16"
0,50 mm	Až 50 ml/min	oranžový	1/16"
0,75 mm	Až 100 ml/min	Zelená	1/16"
1,0 mm	Až 200 ml/min	Šedá	1/16"
1,59 mm	Až 500 ml/min		1/8"".
2,40 mm	Až 1000 ml/min		1/8"".

Palce na mm – palec x 25,4 = mm

Stopy na metr – stopy x 0,3048 = metr

Tlak na koloně při průtoku 1 ml/min

P = 2,1 x d x 10,13 x h / h ² x vp ²

P – tlak (MPa)
L – délka kolony v mm
h - dynamická viskozita (pro vodu = 1)
d – vnitřní průměr kolony v mm
vp – velikost částic v µm

Tlak na koloně 4,6 x 250 mm, 5 um bude při průtoku 1,0 ml/min cca 100 bar

Volba kolony v závislosti na velikosti nástřiku a její kapacitě

ID (mm)	Hodnota nástřiku (µl)	Kapacita kolony (mg)	Průtok (ml/min)
4,6	5-100	1	0,5 – 2,0
10	100–1000	5	4,0 – 15,0
21,2	1000–5000	20	10 – 50
30	2000 – 10 000	40	40 – 100
50	5000 – 20 000	120	100–300
100	10 000 – 50 000	500	400–1000

pK kyselin a zásad používaných jako aditivum pro mobilní fáze HPLC

pK_a kyselých a zásaditých pufrů v HPLC pro přípravu mobilní fáze

Kyselý pufr	Teplota (°C)	pK ₁	pK ₂		pK ₃
ACES 2-[(2-amino-2-oxoethyl)amino]ethansulfonová kyselina	20	6.9	-		-
Octová kyselina	25	4.8	-		-
Kyselina boritá	20	9.1	12.7		13.8
CAPS 3-(cyklohexylamino)ethansulfonová kyselina	20	10.4	-		-
Kyselina citronová	25	3.1	4.8		6.4
Kyselina mravenčí	20	3.8	-		-
Glycin	25	2.3	9.6		-
Glycylglycin	20	8.4	-		-
HEPES N-2-hydroxyethylpiperazin-N'-2-ethansulfonová kyselina	20	7.6	-		-
Imidazol	20	7,0	-		-
MES 2-(N-morfolino)ethansulfonová kyselina	20	6.2	-		-
MOPS 3-(N-morfolino)propansulfonová kyselina	20	7.2	-		-
Kyselina šťavelová	25	1.3	4.3		-
Kyselina fosforečná	25	2.1	7.2		12.7
TES 2-[tris(hydroxymethyl)methyl]aminoethansulfonová kyselina	20	7.5	-		-
Kyselina trifluoroctová	25	0,3	-		-
Tricin N-[tris(hydroxymethyl)methyl]glycin	20	8.2	-		-
TRIS Tris(hydroxylmethyl)aminomethan	20	8.3	-		-
_pKb bází při HPLC pro přípravu mobilní fáze
Zásaditý pufr	teplota (°C)	pK ₁	pK ₂	pK ₃
Amoniak	25	9.3	-	-
Diethylamin	20	11.1	-	-
dimethylamin	25	10.7	-	-
Ethylamin	20	10.8	-	-
Ethylendiamin	20	10.1	7,0	-
methylamin	25	10.7	-	-
Morfolin	25	8.3	-	-
triethylamin (TEA)	18	11.0	-	-
trimethylamin	25	9.8	-	-

Pozn: Rozmezí pH, pro které je vhodný vhodný je v rozsahu pK ± 1. Je třeba vzít v úvahu UV Cutoff použitého pufru (tab. 2)

Aplikace a podpora v UHPLC

Chronometr Přenos metody (z konvenční HPLC do UHPLC)

Kapacita vzorků (jak ovlivní menší částice kapacitu vzorků?)

Přenos metod z klasické HPLC do UHPLC vyžaduje nejprve optimalizaci selektivity a účinnosti kolony pro požadovanou aplikaci. Jakmile je tato část vývoje metody hotová, můžeme přistoupit k přenosu metody do UHPLC. K tomu nám poslouží několik jedhoduchých výpočtů, které pomohou stanovit ekvivalentní podmínky separace. Tento článek je postupně popisuje.

Volba délky kolony

První výpočet stanovuje vhodnou délku chromatografické kolony. Při zachování délky kolony a snižování velikosti částic se zvýší počet teoretických pater dané kolony. Proto můžeme kolonu zkrátit aniž bychom ztratili rozlišení. Použitím vzorce 1 a volbou vhodné délky kolony docílíme zachování stejné separace jako u knovenční HPLC.

Optimalizace nástřikového objemu

Jakmile jsme stanovili vhodnou délku kolony, můžeme optimalizovat objem nástřiku. Snižováním vnitřního průměru a délky kolony se sníží její celkový objem a kapacita vzorku. Proto musíme upravit nástřikový objem podle vzorce 2. Zde je nutné si uvědomit, že díky snížení celkového objemu kolony je velice důležité, aby byla zajištěna kompatibilita rozpouštědla vzorku se složením mobilní fáze. V opačném případě dojde k nereprodukovatelnosti retenčních časů, účinnosti a dokonce může dojít ke změně selektivity.

Nastavení průtoku

Průtok je nutné nastavit tak, aby byla u menší kolony zajištěna vhodná lineární rychlost. Ta je definována jako vzdálenost, kterou dosáhne mobilní fáze za časovou jednotku (na rozdíl od průtoku, který je definován jako objem mobilní fáze, který prochází chromatografickou kolonou za čas). Abychom zachovali stejnou lineární rychlost, která je důležitá pro zachování účinnosti, musí být průtok mobilní fáze snížen se zmenšením průměru kolony. U izokratické separace lze průtok kolonou vypočítat podle vzorce 3 (nutno vzít v úvahu i velikost částic). Tím bychom měli snadno a rychle odhadnout nastavení průtoku pro ekvivalentní chromatografii. Zde je důležité si uvědomit, že částice s velikostí pod 2µm jsou méně ovlivňovány při vyšších průtocích a proto mohou být použity vyšší průtoky v izokratických separacích bez škodlivých účinků na účinnost separace.

Nastavení časového programu

Na závěr, po optimalizaci délky kolony, nástřikového objemu a průtoku, můžeme přistoupit k nastavení začátku gradientu. Při přenosu metody z konvenční HPLC do UHPLC musíme upravit počátek gradientu tak, aby docházelo k interakcím fáze ve stejnou dobu. Tu nastavíme pomocí vzorce 4.

Literatura: Rick Lake, Restek Corporation

Vizkozita rozpouštědel

Závislost viskozity směsí rozpouštědel na jejích procentuálním složení

% vody	viskozita (MeOH/voda)	viskozita (AcCN/voda)
0	0.65	0.35
10	0.95	0.50
20	1.20	0.55
30	1.60	0.70
40	1.75	0.80
50	1.90	0.90
60	1.80	1.00
70	1.75	1.05
80	1.65	1.10
90	1.40	1.05
100	1.00	1.00

Tabulky pro chromatografii

Volba kapiláry pro různé průtoky

Výběr kolony v závislosti na velikosti nástřiku a kapacitě kolony

UV cutoff aditiv mobilních fází

pK_a kyselých pufrů v mobilních fázích pro HPLC

pK_b bází v mobilních fázích pro HPLC

Přepočty jednotek tlaku

Odhad tlaku na kolonách v závislosti na velikosti částic, průměru a délce kolony

Viskozity směsí rozpouštědel

Vlastnosti rozpouštědel