UHPLC

UHPLC

Ultra-High Performance Liquid Chromatography je milníkem ve vývoji kapalinové chromatografie. Využívá chromatografické kolony s částicemi <2µm, které se používají v analytických přístrojích schopných pracovat s vysokými tlaky. To umožňuje extrémně rychlé separace s vysokou účinností. UHPLC je velmi účinná chromatografická technika, která nabízí práci s širokým rozsahem průtoků a významně zkracuje dobu analýzy.

• Přístrojová technika
• UHPLC kolony
• Aplikace a podpora
• Dosažení UHPLC výkonu na jakémkoliv LC přístroji
• Reagencie

Vliv na účinnost

S klesající velikostí částic, vzrůstá i účinnost separace (viz graf níže). S nižším průměrem částic významně vzrůstá tlak na koloně. To má za následek extrémně vysoký tlak u delších LC kolon. To znamená, že u standardních LC systémů nelze používat kolony s částicemi 1,9 µm o stejné délce, jakou mají běžné 5µm HPLC kolony (např. 250 mm). Proto mají UHPLC kolony nižší nebo podobnou účinnost jako mají standardní HPLC kolony. To, co odlišuje UHPLC kolony od standardních, je výrazně rychlejší doba analýzy, nikoliv však účinnost.

Potřebujete-li zvýšit účinnost separace, je zapotřebí nejprve zvolit vhodnou stacionární fázi, jejíž selektivita bude pro požadovanou separaci nejvyšší.

Reagencie pro UHPLC

UHPLC přístroje vyžadují rozpouštědla a chemikálie mnohem vyšší čistoty, než rozpouštědla, která jsou v současné době na trhu. ULC/MS rozpouštědla, pufry a modifikátory (Biosolve) mají maximální čistotu, jakoutato instrumentace vyžaduje:

• velmi nízký posun UV signálu při gradientní eluci
• minimální obsah nečistot
• nejnižší pozadí (obsah iontů) v MS detektorech
• méně než 100 ppb alkalických kovů

Rozpouštědla pro ULC/MS jsou filtrována přes mikrofiltr 0,1 µm, mají odparek max. 1 ppm a jsou balena v inertní atmosféře, čímž je zajištěna jejich delší stabilita při skladování. Kromě standardního 2,5 l balení Biosolve nabízí i reagencie pro nano LC/MS:

• 500 ml balení acetonitrilu, metanolu a isopropanolu
• 1 l balení ultra-čisté vody
• 100 ml TFA

Další informace o dodávaných reagenciích si vyžádejte u našich zástupců nebo kanceláří.

Aplikace a podpora v UHPLC

Přenos metody (z konvenční HPLC do UHPLC)

Kapacita vzorků (jak ovlivní menší částice kapacitu vzorků?)

Přenos metod do UHPLC

Přenos metod z klasické HPLC do UHPLC vyžaduje nejprve optimalizaci selektivity a účinnosti kolony pro požadovanou aplikaci. Jakmile je tato část vývoje metody hotová, můžeme přistoupit k přenosu metody do UHPLC. K tomu nám poslouží několik jedhoduchých výpočtů, které pomohou stanovit ekvivalentní podmínky separace. Tento článek je postupně popisuje.

Volba délky kolony

První výpočet stanovuje vhodnou délku chromatografické kolony. Při zachování délky kolony a snižování velikosti částic se zvýší počet teoretických pater dané kolony. Proto můžeme kolonu zkrátit aniž bychom ztratili rozlišení. Použitím vzorce 1 a volbou vhodné délky kolony docílíme zachování stejné separace jako u knovenční HPLC.

Optimalizace nástřikového objemu

Jakmile jsme stanovili vhodnou délku kolony, můžeme optimalizovat objem nástřiku. Snižováním vnitřního průměru a délky kolony se sníží její celkový objem a kapacita vzorku. Proto musíme upravit nástřikový objem podle vzorce 2. Zde je nutné si uvědomit, že díky snížení celkového objemu kolony je velice důležité, aby byla zajištěna kompatibilita rozpouštědla vzorku se složením mobilní fáze. V opačném případě dojde k nereprodukovatelnosti retenčních časů, účinnosti a dokonce může dojít ke změně selektivity.

Nastavení průtoku

Průtok je nutné nastavit tak, aby byla u menší kolony zajištěna vhodná lineární rychlost. Ta je definována jako vzdálenost, kterou dosáhne mobilní fáze za časovou jednotku (na rozdíl od průtoku, který je definován jako objem mobilní fáze, který prochází chromatografickou kolonou za čas). Abychom zachovali stejnou lineární rychlost, která je důležitá pro zachování účinnosti, musí být průtok mobilní fáze snížen se zmenšením průměru kolony. U izokratické separace lze průtok kolonou vypočítat podle vzorce 3 (nutno vzít v úvahu i velikost částic). Tím bychom měli snadno a rychle odhadnout nastavení průtoku pro ekvivalentní chromatografii. Zde je důležité si uvědomit, že částice s velikostí pod 2µm jsou méně ovlivňovány při vyšších průtocích a proto mohou být použity vyšší průtoky v izokratických separacích bez škodlivých účinků na účinnost separace.

Nastavení časového programu

Na závěr, po optimalizaci délky kolony, nástřikového objemu a průtoku, můžeme přistoupit k nastavení začátku gradientu. Při přenosu metody z konvenční HPLC do UHPLC musíme upravit počátek gradientu tak, aby docházelo k interakcím fáze ve stejnou dobu. Tu nastavíme pomocí vzorce 4.

Literatura: Rick Lake, Restek Corporation