MetAmino - набор для пробоподготовки

Введение

Аминокислоты являются ключевыми строительными блоками жизни и играют ключевую роль в различных метаболических путях. В основном они действуют как промежуточные соединения, часто не задействуя напрямую белки. Из-за их химической сложности и динамического диапазона их надежный количественный и качественный анализ в биологических жидкостях и тканях имеет решающее значение для получения информации о питании, идентификации соединений и диагностики.

С этой целью был разработан простой, элегантный и на сегодняшний день самый быстрый метод анализа незаменимых аминокислот. Набор Metamino® на основе ЖХ/ГХ-МС предлагает комплексное решение до 75 метаболитов, включая основные протеиногенные аминокислоты, биогенные амины и коферменты, с возможностью дальнейшего расширения аналитов.

Данные масс-хроматограммы

Гигант. 1: Масс-хроматограмма внутренних стандартов SD1 и SD2. Разделение 5 нмоль аминокислот с помощью LC-MS Metamino®

Гигант. 2: Масс-хроматограмма реального образца: Разделение аминокислот в формуле пива Budvar 12˚ (25 мкл образца было нанесено на колонку). Высокая эффективность и высокое разрешение нашей колонки способствуют хорошему разделению пиков. Образец протестирован с помощью LC-MS Metamino®

Гигант. 3: Масс-хроматограмма реального образца: разделение аминокислот, присутствующих в сыворотке крови (25 мкл осажденной сыворотки наносили на колонку). Высокая эффективность и высокое разрешение нашей колонки способствуют хорошему разделению пиков. Образец протестирован с помощью LC-MS Metamino®

Базовые приготовления

После извлечения содержимого из матрицы можно приступить к подготовке проб для анализа ЖХ-МС/ГХ-МС.

Этот протокол лишь кратко описывает процедуру подготовки проб. Подробную процедуру можно найти в руководстве пользователя Metamino^®.

Анализ ЖХ-МС происходит следующим образом:

1. Отнесите пипеткой 100 мкл извлеченного содержимого (сыворотки, плазмы и т. д.) и добавьте 100 мкл среды осаждения. Центрифуга в течение 30–60 секунд при 1500 г (6000 об/мин).
2. Отнесите пипеткой 25 мкл осажденного образца и добавьте 10 мкл раствора внутреннего стандарта в каждый флакон для подготовки проб.
3. Внесите пипеткой 25 мкл раствора катализатора в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд.
4. Внесите пипеткой 10 мкл раствора реагента в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд. Разрешить дериватизации продолжаться в течение по крайней мере 2-3 минут.
5. Активируйте и уравновесьте сорбент в микроспиновом фильтре добавлением:
   1. 200 мкл среды активации MSPE, затем центрифугируйте в течение 30–60 секунд при 1500 g (6000 об/мин).
   2. 200 мкл уравновешивающей сорбентной среды MSPE, затем центрифугируйте в течение 30–60 секунд при 1500 g (6000 об/мин).
6. Вылейте элюат через мембрану.
7. Разбавьте реакционную смесь дериватизации 400 мкл среды для разбавления и промывки и перемешайте на вортексе в течение 5-10 секунд.
8. Разбавленную реакционную смесь (обычно 450-500 мкл) наносят на увлажненный сорбент микроспинового фильтра и оставляют на 1-2 минуты. Центрифуга в течение 30–60 секунд при 1500 г (6000 об/мин).
9. Вылейте элюат через мембрану.
10. Сорбент промывают на микроспиновом фильтре 200 мкл разбавленной и промывной среды и центрифугируют от 30 до 60 секунд при 1500 g (6000 об/мин).
11. Поместите микроспиновый фильтр в новый флакон для центрифуги, добавьте 200 мкл элюирующей среды и центрифугируйте в течение 30–60 секунд при 1500 г (6000 об/мин).
12. Перенесите элюат во флакон автосамплера. Образец готов к анализу ЖХ-МС.

ГХ-МС анализ происходит следующим образом:

1. Внесите пипеткой 25 мкл целевого образца и 10 мкл раствора внутреннего стандарта в каждую стеклянную реакционную пробирку.
2. Внесите пипеткой по 20 мкл восстановителя в каждую стеклянную реакционную пробирку и кратковременно перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд. Дайте постоять 1-2 минуты.
3. Внесите пипеткой по 25 мкл исходной среды в каждую реакционную стеклянную пробирку и добавьте 50 мкл раствора реагента (дериватизации) в каждую реакционную стеклянную пробирку и встряхивайте в течение 5–10 секунд.
4. Внесите пипеткой 25 мкл раствора катализатора в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд.
5. Внесите пипеткой 25 мкл раствора катализатора в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд. Дайте постоять 1-2 минуты. Эмульсия постепенно разделяется на два слоя.
6. Внесите пипеткой 50 мкл экстракционной среды в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд.
7. Внесите пипеткой 25 мкл кислой среды в каждый флакон для подготовки проб и перемешайте на вортексе в течение 5–10 секунд. Затем центрифугируйте в течение 30–60 секунд при 1500 g (6000 об/мин).
8. Перенесите органический (верхний) слой (50–100 мкл) во флакон автосамплера с вкладышем. Образец готовят для анализа ГХ-МС.

Содержимое набора

Набор MetAmino ^® содержит все реагенты, среды и химикаты. Содержимое стартового набора указано в таблицах ниже:

Содержимое набора ЖХ-МС на 100 образцов:

Состав набора ГХ-МС на 100 образцов:

Функции

• В принципе подходит для любых матриц (моча, сыворотка крови, слеза, церебральная жидкость, экстракты тканей, экстракты почвы и т.д.)
• Простая подготовка проб
• Дериватизация и анализ образца менее 20 минут
• Широкий портфель аналитов (75) с возможностью дальнейшего расширения.
• Не требуется нагревание/замораживание пробы
• Доступна библиотека NIST для ГХ/МС
• Возможно определение веществ с низкой молекулярной массой, которые могут разлагаться в источнике ионов (например, GLY, ALA и т. д.).
• Подходит для анализа веществ, которые трудно определить количественно, например, полиаминов.
• В комплект входят все необходимые реагенты, аксессуары, колонка для ВЭЖХ и четкие инструкции по дериватизации и анализу с высокой точностью и чувствительностью.

Описание

Наши наборы MetAmino ^® LC-MS и GC-MS обеспечивают быструю, надежную, воспроизводимую и точную процедуру анализа аминокислот, которая включает как подготовку проб, так и хроматографическое разделение.

Метод ЖХ-МС основан на твердофазной микроэкстракции с использованием специальных микроспиновых фильтров ( МСПЭ ) с недавно разработанным сорбентом и встроенной мембраной 0,22 мкм, метод ГХ-МС использует жидкостно-жидкостную микроэкстракцию ( ЖЖМЭ ). для подготовки. После этой предварительной обработки образец анализируют с помощью ЖХ-МС (ГХ-МС). В общей сложности подготовка образца для ЖХ-МС занимает около 8 минут, а анализ образца — 12 минут, поэтому все время эксперимента составляет всего 20 минут. Общее время эксперимента ГХ-МС еще короче – около 17 минут.

Этот уникальный набор отвечает всем лабораторным требованиям и предназначен для всех конечных пользователей, которым нужен простой аналитический метод и высокая эффективность разделения.

Часто задаваемые вопросы о МетАмино

Какой тип мембраны внутри спинового фильтра?

• Мембрана изготовлена из нейлонового материала и имеет пористость 0,22 мкм. Его диаметр оптимизирован для использования с данным спиновым фильтром.

Можно ли расширить набор ^MetAmino® другими аналитами?

• Да, набор ^MetAmino® можно расширить. Свяжитесь с нами для получения подробной информации.

Могу ли я использовать набор ^MetAmino® для анализа мочи?

• Да, набор ^MetAmino® можно использовать для анализа мочи. Образец не должен содержать белков, поэтому перед использованием набора его необходимо обработать обычным способом (центрифугирование, фильтрация).

Можем ли мы заказать реагенты отдельно?

• Да, весь набор реагентов можно заказать под каталожным номером MAK-5857-L002 .

Какое давление во время анализа ЖХ/МС?

• В начале анализа давление 380 бар, в конце 200 бар.

Созданы ли MRM для аминокислот, перечисленных в наборе ^MetAmino®, после или до дериватизации стандартов?

• Переходы MRM для AA, перечисленные в руководстве, указаны как переходы производных AA, а не собственного AA.

Следует ли гидролизовать образец корма перед работой с набором ^MetAmino® ?

• Осаждение с использованием осаждающей среды (PM) не является необходимым шагом для успешной дериватизации образца. Набор тестировался в первую очередь для анализа биожидкостей, часто содержащих пептиды. Для предотвращения их осаждения в процессе дериватизации в протокол пробоподготовки был включен этап осаждения.
• Если требуется общий анализ свободных и связанных с пептидами аминокислот, в этом случае мы рекомендуем провести гидролиз образца, а затем высушить аликвоту гидролизованного образца в токе азота или в спидваке. Растворяют высушенный остаток в 25 мкл деионизированной воды или 0,1 М водного раствора HCl (для лучшей растворимости) и действуют согласно инструкции, добавляя 10 мкл раствора IS.
• Что касается гидролиза пептидов, используемые добавки (фенол, тиодигликоль) в среде гидролиза также могут быть дериватизированы (вероятно, не видны при « полном сканировании »). Поэтому мы рекомендуем 6M HCl в качестве среды гидролиза.

Можем ли мы заказать набор ^MetAmino® GC/MS для подготовки 400 образцов?

• Пока нет, в настоящее время у нас есть только набор ^MetAmino® GC/MS для подготовки 100 образцов. Этот комплект можно заказать под каталожным номером MAK-5857-BA01.

В таблице 78 аминокислот, некоторые из которых отсутствуют в доступных стандартных смесях — так должны ли мы полагаться на переходы MRM и смотреть на время удерживания, или это стандарты, которые мы должны купить, если мы хотим их определить?

• Для количественного определения набор MetAmino содержит - один флакон стандартного раствора SD1, входящего в состав набора, содержит 33 аминокислоты: AAA, ABA, ALA, APA, ARG, ASP, BAIBA, CC, CIT, CTH, GABA, GLU, GLY. , GPR, HIS, HLY, HYP, ILE, LEU, LYS, MET, 1MHIS, 3MHIS, ORN, PHE, PHP, PRO, SAR, SER, THR, TPR, TYR, VAL и SD2 во флаконе с лиофилизированной смесью 3 аминокислот : АСН, ГЛН, ГТО. Однако набор аминокислот может быть дополнительно расширен за счет других соединений, содержащих первичные или вторичные функциональные аминогруппы.
• Массы (m/z), указанные в руководстве, верны и представляют собой ионы M+H+. Массы (m/z) и время удерживания из руководства были получены с помощью прибора с линейной ионной ловушкой LTQ, а данные из Сертификата анализа были получены с прибора Q Exactive plus HRMS. В обоих случаях использовали одну и ту же колонку, скорость потока и состав подвижной фазы. Время удерживания (ВУ) является экспериментальным значением, и расхождения, особенно для соединений с поздним элюированием, могут быть вызваны использованием разных приборов ЖХ/МС.