MetAmino - súprava na prípravu vzoriek

Úvod

Aminokyseliny sú kľúčovými stavebnými kameňmi života a zohrajú dôležitú úlohu v rôznych metabolických dráhach. Väčšinou pôsobia ako medziprodukty, ktoré často priamo nezahŕňajú proteíny. Vzhľadom na ich chemickú zložitosť a dynamickú povahu je ich spoľahlivá kvantitatívna a kvalitatívna analýza v biologických tekutinách a tkanivách kľúčová pre nutričné informácie, identifikáciu zlúčenín a diagnostiku.

Na tento účel bola vyvinutá jednoduchá, elegantná a doteraz najrýchlejšia metóda na analýzu aminokyselín. Kit MetAmino^® na báze LC/GC-MS ponúka komplexné riešenie pre 75 metabolitov vrátane základných proteinogénnych aminokyselín, biogénnych amínov a koenzýmov s možnosťou ďalšieho rozšírenia analytov.

Chromatogramy

Obr. 1: Chromatogram vnútorných štandardov, SD1 a SD2. Separácia 5 nmol aminokyselín pomocou LC-MS MetAmino^®

Obr. 2: Chromatogram reálnej vzorky: Separácia aminokyselín vo vzorke piva Budvar 12˚ (25 µl vzorky bolo nanesenej na kolónu). Vysoká účinnosť našej kolóny a vysoké rozlíšenie prispievajú k peknej separácii signálov. Vzorka testovaná pomocou LC-MS MetAmino^®

Obr. 3: Chromatogram reálnej vzorky: Separácia aminokyselín prítomných v krvnom sére (25 µL vyzrážaného séra bolo naneseného na kolónu). Vysoká účinnosť našej kolóny a vysoké rozlíšenie prispievajú k peknej separácii signálov. Vzorka testovaná pomocou LC-MS MetAmino^®

Príprava vzoriek

Nižšie je uvedený stručný postup prípravy vzorky. Podrobný postup nájdete v užívateľskej príručke MetAmino^® .

Príprava vzorky pre LC-MS analýzu prebieha nasledovne:

Napipetujte 100 μl vašej vzorky (sérum, plazma, ...) do centrifugačnej skúmavky a pridajte 100 μL precipitačného média. Centrifugujte 30 až 60 sekúnd pri 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Napipetujte 25 μl vašej vyzrážanej vzorky do novej centrifugačnej skúmavky a pridajte 10 μl roztoku s vnútornými štandardmi.
Napipetujte 20 μl katalytického roztoku a 5-10 sekúnd vortexujte.
Napipetujte 10 μl reagenčného (derivatizačného) činidla a vortexujte 5-10 sekúnd. Nechajte derivatizáciu prebiehať aspoň 2-3 minúty.
Aktivujte a ekvilibrujte sorbent v MSPE filtri pridaním:
1. 200 μl aktivačného média sorbentu MSPE, potom centrifugujte 30 až 60 sekúnd pri 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
2. 200 μl ekvilibračného média sorbentu MSPE, potom centrifugujte 30 až 60 sekúnd pri 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Vylejte eluát prešlý membránou.
Derivatizačnú reakčnú zmes zrieďte 400 μl riediaceho a premývacieho média a vortexujte 5-10 sekúnd.
Zriedenú reakčnú zmes (typicky 450-500 μl) naneste na aktivovaný a naekvilibrovaný MSPE filter a nechajte 1-2 minúty stáť. Centrifugujte 30 až 60 sekúnd pri 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Vylejte eluát prešlý membránou.
Premyte sorbent v MSPE filtri 200 μl zrieďovacieho a premývacieho média a centrifugujte 30 až 60 sekúnd pri 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Umiestnite MSPE filter do novej centrifugačnej skúmavky, pridajte 200 μl elučného média a centrifugujte 30 až 60 sekúnd pri 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Preneste eluát do novej vialky a umiestnite ju do autosamplera. Vzorka je pripravená pre LC-MS analýzu.

Príprava vzorky pre GC-MS analýzu prebieha nasledovne:

Do reakčnej sklenenej skúmavky napipetujte 25 μl vzorky a 10 μl roztoku s vnútornými štandardmi.
Do reakčnej sklenenej skúmavky napipetujte 20 μl redukčného činidla a krátko, 5 až 10 sekúnd, vortexujte. Nechajte 1 až 2 minúty pôsobiť.
Do reakčnej sklenenej skúmavky napipetujte 25 μl základného roztoku.
Potom pridajte 50 μl reagenčného (derivatizačného) činidla a vortexujte 5 až 10 sekúnd.
Napipetujte 25 μl katalytického roztoku do reakčnej sklenenej skúmavky a 5 až 10 sekúnd vortexujte.
Znovu napipetujte 25 μl katalytického roztoku do reakčnej sklenenej skúmavky a 5 až 10 sekúnd vortexujte. Nechajte 1-2 minúty odstáť. Emulzia sa postupne rozdelí na dve vrstvy.
Napipetujte 50 μl extrakčného média do reakčnej sklenenej skúmavky a 5 až 10 sekúnd vortexujte.
Napipetujte 25 μl kyslého média do reakčnej sklenenej skúmavky a 5 až 10 sekúnd vortexujte. Potom centrifugujte 30 až 60 sekúnd 1 500 ×g (6 000 ot./min.).
Preneste organickú (hornú) vrstvu (50-100 µL) do autosamplerovej vialky s inzertom. Vzorka je pripravená na analýzu GC-MS.

Obsah sady

MetAmino^® kit obsahuje všetky činidlá, médiá a chemikálie. Obsah štartovacej sady je uvedený v tabuľkách nižšie:

Obsah súpravy LC-MS pre 100 vzoriek:

Položka	Typ vialky	Objem vo vialke (ml)	Počet vialiek (100 vzoriek)
Štandardy aminokyselín SD1 roztok	2 ml vialka	0,25	1
Štandardy aminokyselín SD2 v práškovej forme	2 ml vialka	-	2
Roztok s vnútornými štandardmi (IS)	2 ml vialka	1,1	1
Aminokyselinové štandardné riediace médium (AASDM)	4 ml vialka	1,4	1
Aktivačné médium sorbentu MSPE (WES)	40 ml vialka	22	1
Ekvilibračné médium sorbentu MSPE (EQS)	40 ml vialka	22	1
Katalytický roztok (CTS)	4 ml vialka	2,2	1
Reagenčné (derivatizačné) činidlo (RDS)	4 ml vialka	1,1	1
Zrieďovacie a premývacie médium (DWM)	40 ml vialka	33	2
Elučné médium (ELM)	40 ml vialka	22	1
Precipitačné médium (PM)	40 ml vialka	11	1

Položka	Množstvo (100 vzoriek)	Poznámka
MetAmino^® HPLC kolóna	1 ks	Špeciálna stacionárna fáza
Stojan až pre 80 centrifugačných skúmaviek	1 ks
Microspin filtre so sorbentom MetAmino^®	100 ks	Vnútorná kolónka vr. 0,22µm membrány
Centrifugačné skúmavky (2 ml)	400 ks
Autosamplerové vialky (9 mm skrutkovací uzáver)	100 ks	Vrátane sept a viečok

Obsah súpravy GC-MS pre 100 vzoriek:

Položka	Typ vialky	Objem vo vialke (ml)	Počet vialiek (100 vzoriek)
Štandardy aminokyselín SD1 (roztok)	2 ml vialka	0,25	1
Štandardy aminokyselín SD2 v práškovej forme	2 ml vialka	-	2
Roztok s vnútornými štandardmi (IS)	2 ml vialka	1,1	1
Aminokyselinové štandardné riediace médium (AASDM)	4 ml vialka	1,4	1
Redukčné činidlo (RA)	4 ml vialka	2,75	1
Základný roztok (BM)	4 ml vialka	2,75	1
Katalytický roztok (CTS)	40 ml vialka	5,5	1
Reagenčné (derivatizačné) činidlo (RDS)	40 ml vialka	5,5	1
Extrakčné médium (EM)	40 ml vialka	5,5	1
Kyslé médium (AM)	4 ml vialka	2,75	1

Položka	Množstvo	Poznámka
MetAmino^® GC kolóna	1 ks	Špeciálna stacionárna fáza
Reakčné sklenené skúmavky	100 ks	-
Stojan pre 80 reakčných skúmaviek
Autosamplerové vialky (9 mm skrutkovací uzáver)	100 ks	Vrátane sept a viečok
Inserty do vialiek autosamplera	100 ks	-

Vlastnosti

V zásade vhodný pre akékoľvek matrice (moč, krvné sérum, slzy, mozgová tekutina, tkanivové extrakty, pôdne extrakty atď.)
Jednoduchá príprava vzorky
Derivatizácia a analýza vzorky do 20 minút
Široké portfólio analytov (75) s možnosťou ďalšieho rozšírenia
Nie je potrebné zahrievanie/zmrazovanie vzorky
Knižnica NIST pre GC/MS je k dispozícii
Možnosť analyzovať látky s nízkou molekulovou hmotnosťou, ktoré môžu byť degradované v iónovom zdroji (napr. GLY, ALA atď.)
Vhodné na analýzu látok, ktoré sa ťažko kvantifikujú, ako sú polyamíny
Súčasťou sú všetky potrebné chemikálie, príslušenstvo, HPLC kolóna a návod na derivatizáciu a analýzu s vysokou presnosťou a citlivosťou

Popis

Naše sady MetAmino^® LC-MS a GC-MS poskytujú rýchlu, robustnú, reprodukovateľnú a precíznu metódu pre analýzu aminokyselín, ktorá zahŕňa ako prípravu vzoriek, tak aj chromatografickú separáciu.

Metóda využívajúca LC-MS je založená na mikro-extrakcii na pevnej fáze využívajúc špeciálne mikrospin filtre ( MSPE ) s novo vyvinutým sorbentom a integrovanou membránou 0,22 µm, metóda GC-MS využíva na prípravu mikroextrakciu kvapalina-kvapalina ( LLME ). Po tejto predúprave je vzorka analyzovaná v LC-MS (GC-MS). Celkovo trvá príprava vzorky pre LC-MS asi 8 minút a analýza vzorky 12 minút, takže celá doba experimentu je iba 20 minút. Celková doba experimentu GC-MS je dokonca kratšia - zhruba 17 minút.

Táto jedinečná sada spĺňa všetky požiadavky laboratórií a je navrhnutá pre všetkých koncových užívateľov, ktorí hľadajú jednoduchú analytickú metódu a vysokú účinnosť separácie.

MetAmino FAQ

Aký je typ membrány vo vnútri spin filtra?

Membrána je vyrobená z materiálu NYLON a jej porozita je 0,22 µm. Jej priemer je optimalizovaný na použitie s daným spin filtrom.

Je možné rozšíriť MetAmino ^® kit o ďalšie analyty?

Áno, MetAmino ^® kit je možné ďalej rozširovať. Kontaktujte nás s detailnými informáciami.

Môžem použiť MetAmino ^® kit na analýzu moču?

Áno, MetAmino ^® kit možno použiť na analýzu moču. Vzorka nesmie obsahovať bielkoviny, takže pred použitím kitu musí byť upravený bežným spôsobom (odstreďovanie, filtrácia).

Môžeme objednať reagencie samostatne?

Áno, celú súpravu reagencií je možné objednať pod katalógovým číslom MAK-5857-L002 .

Aký je tlak v priebehu LC/MS analýzy?

Na začiatku analýzy je tlak 380 barov, na konci je 200 barov.

Sú MRM pre aminokyseliny uvedené v MetAmino ^® kitu vytvorené po derivatizácii štandardov alebo pred ňou?

Prechody MRM pre AA uvedené v návode sú uvedené ako prechody derivátov AA a nie natívnych AA.

Mala by byť vzorka krmiva pred prácou so súpravou MetAmino ^® kitu hydrolyzovaná?

Precipitácia pomocou precipitačného média (PM) nie je nevyhnutným krokom pre úspešnú derivatizáciu vzorky. Kit bol testovaný predovšetkým na analýzu biofluidov, ktoré často obsahujú peptidy. Aby sa zabránilo ich zrážaniu počas derivatizácie, bol krok zrážania zahrnutý do protokolu prípravy vzorky.
Pokiaľ je vyžadovaná celková analýza voľných a na peptid viazaných aminokyselín, v tomto prípade by sme odporučili vzorku hydrolyzovať a potom alikvot hydrolyzovanej vzorky vysušiť pod prúdom dusíka alebo v speedvacu. Vysušený zvyšok rozpustite v 25 µl deionizovanej vody alebo 0,1M vodnej HCl (pre lepšiu rozpustnosť) a postupujte podľa návodu pridaním 10 µl roztoku IS.
Pokiaľ ide o hydrolýzu peptidov, používané aditíva (fenol, tiodiglykol) v hydrolyzačnom médiu by tiež mohli byť derivatizované (pravdepodobne nebudú vidieť vo " full scan "). Preto ako hydrolyzačné médium odporúčame 6M HCl.

Môžeme si objednať MetAmino ^® GC/MS kit na prípravu 400 vzoriek?

Zatiaľ nie, v súčasnej dobe máme iba MetAmino ^® GC/MS kit na prípravu 100 vzoriek. Túto súpravu je možné objednať pod katalógovým číslom MAK-5857-BA01.

V tabuľke je 78 aminokyselín, z ktorých niektoré nie sú v dostupných mixoch štandardov – máme sa teda spoliehať na MRM prechody a pozerať sa na retenčný čas alebo sú to štandardy, ktoré by sme si mali kúpiť, ak ich chceme určovať?

Na účely kvantifikácie obsahuje sada MetAmino - jedna fľaštička štandardného roztoku SD1 obsiahnutého v sade obsahuje 33 aminokyselín: AAA, ABA, ALA, APA, ARG, ASP, BAIBA, CC, CIT, CTH, GABA, GLU, GLY, GPR, HIS, HLY , HYP, ILE, LEU, LYS, MET, 1MHIS, 3MHIS, ORN, PHE, PHP, PRO, SAR, SER, THR, TPR, TYR, VAL a fľaštička SD2 s lyofilizovanou zmesou 3 aminokyselín: ASN, GLN, TRP. Sada aminokyselín však môže byť ďalej rozšírená na ďalšie zlúčeniny obsahujúce primárne alebo sekundárne amino funkčné skupiny.
Hmotnosti (m/z) uvedené v príručke sú správne a predstavujú ióny M+H+. Hmotnosti (m/z) a retenčné časy z manuálu boli získané z prístroja LTQ s lineárnou iónovou pascou, avšak dáta z Certifikátu analýzy boli získané z prístroja Q Exactive plus HRMS. V oboch prípadoch bola použitá rovnaká kolóna, prietok a zloženie mobilnej fázy. Retenčné časy (RT) sú experimentálne hodnoty a nezrovnalosti, najmä u zlúčenín s neskorou elúciou, by boli spôsobené použitím rôznych LC/MS prístrojov.