HPLC závady a jejich odstranění

Abnormálny tlak

Žiadne meranie tlaku, žiadny prietok

Možná príčina	Riešenie
Vypnúť	Zapnite napájanie
Vypálená poistka	Vymeňte poistku
Nastavenie alebo porucha ovládača	Skontrolujte správne nastavenia, opravte alebo vymeňte ovládač
Zlomený piest	Vymeňte piest
Vzduch zachytený v hlave čerpadla	Odplyňte mobilnú fázu, vypustite vzduch z čerpadla a naplňte čerpadlo
Nedostatočná mobilná fáza	Doplňte zásobník, vymeňte vstupnú fritu, ak je zablokovaná
Chybné spätné ventily	Vymeňte spätné ventily
Veľký únik	Dotiahnite alebo vymeňte armatúry

Teraz odčítaný tlak, prietok je normálny

Možná príčina	Riešenie
Chybný merač	Vymeňte merač
Chybný prevodník tlaku	Vymeňte prevodník

Vysoký protitlak

Možná príčina	Riešenie
Prietok nastavený príliš vysoko	Upravte nastavenia
Blokovaná stĺpcová frita	Prepláchnite kolónu, ak je to povolené, vymeňte fritu podľa pokynov výrobcu a záručných podmienok alebo kolónu vymeňte
Nesprávna mobilná fáza, vyzrážaný pufor	Použite správnu mobilnú fázu, premyte kolónu
Nesprávny stĺpec	Použite správny stĺpec
Zablokovanie vstrekovača	Odstráňte zablokovanie alebo vymeňte vstrekovač
Teplota kolóny je príliš nízka	Zvýšte teplotu
Porucha ovládača	Opravte alebo vymeňte ovládač
Zablokovaný ochranný stĺp	Odstráňte/vymeňte ochranný stĺpik
Zablokovaný in-line filter	Odstráňte/vymeňte in-line filter

Mali by ste zistiť, čo spôsobilo vysoký protitlak - stĺpik alebo systém? Odporúčame nasledovný postup:

Odstráňte kolónu zo systému a zapnite čerpadlo. Ak sa stále objaví vysoký protitlak, potom je zablokovanie v systéme:

• zablokované alebo zvlnené potrubie
• špinavá frita čerpadla
• alebo upchatý vstrekovací ventil

Ak je tlak normálny, je problém so stĺpcom:

• upchatý alebo poškodený predkolónový filter, ochranná kolóna alebo frita
• zrážanie vzorky alebo pufra v kolóne

Nízky protitlak

Možná príčina	Riešenie
Prietok nastavený príliš nízko	Upravte prietok
Únik v systéme	Nájdite a opravte
Nesprávny stĺpec	Použite správny stĺpec
Teplota kolóny je príliš vysoká	Nižšia teplota
Porucha ovládača	Opravte alebo vymeňte ovládač

Kolísavý tlak

Pozrite si časť Vysoký protitlak .

Tlak klesá na nulu

Pozrite si časti Žiadny údaj tlaku, žiadny prietok a Žiadny údaj tlaku, prietok je normálny

Tlak klesá, ale nie na nulu

Pozrite si časť Nízky tlak

Cyklovanie tlaku

Možný prípad	Riešenie
Vzduch v čerpadle	Odplyňte rozpúšťadlo a/alebo vypustite vzduch z čerpadla
Chybný spätný ventil(y)	Vymeňte spätný ventil(y)
Porucha tesnenia čerpadla	Vymeňte tesnenie čerpadla
Nedostatočné odplynenie	Odplyňte rozpúšťadlo a/alebo zmeňte metódy odplyňovania (napr. použite vákuový odplyňovač)
Únik v systéme	Nájdite únik a opravte ho
Použitie gradientovej elúcie	Cyklovanie tlaku je normálne v dôsledku zmeny viskozity

---

Netesnosti

Úniky sa zvyčajne zastavia dotiahnutím alebo výmenou armatúry. Uvedomte si však, že príliš utiahnuté kovové kompresné armatúry môžu presakovať a plastové tesniace armatúry sa môžu opotrebovať. Ak netesnosť armatúry neprestane ani po miernom utiahnutí armatúry, armatúru rozoberte a skontrolujte, či nie je poškodená (napr. zdeformovaná objímka alebo častice na tesniacej ploche). Ak je armatúra alebo objímka poškodená, vymeňte ju za novú.

Netesné armatúry

Možná príčina	Riešenie
Voľná montáž	Utiahnite armatúru
Odizolovaná armatúra	Vymeňte armatúru
Príliš utiahnuté kovanie	Uvoľnite a znova utiahnite armatúru. Ak je armatúra poškodená, vymeňte ju.
Špinavá armatúra	Demontujte armatúru a vyčistite ju. Ak je armatúra poškodená, vymeňte ju.
Nezhodné diely	Používajte všetky diely rovnakej značky/typu.

Netesnosti na čerpadle

Možná príčina	Riešenie
Uvoľnené spätné ventily	Utiahnite spätný ventil (neuťahujte príliš) alebo vymeňte spätný ventil
Voľné kovanie	Utiahnite armatúry (neuťahujte príliš)
Porucha tesnenia mixéra	Opravte alebo vymeňte
Porucha tesnenia čerpadla	Opravte alebo vymeňte tesnenie
Porucha tlmiča impulzov	Vymeňte tlmič impulzov
Porucha proporcionálneho ventilu	Skontrolujte membrány, vymeňte ich, ak sú netesné a/alebo skontrolujte, či nie sú poškodené, vymeňte ich
Preplachovací ventil	Utiahnite ventil alebo ho vymeňte, ak je chybný

Netesnosti vstrekovača

Možná príčina	Riešenie
Porucha tesnenia rotora	Prestavte alebo vymeňte rotor
Blokovaná slučka	Vyčistite alebo vymeňte slučku
Uvoľnené tesnenie portu vstrekovača	Upraviť
Nesprávny priemer ihly injekčnej striekačky	Použite správnu injekčnú striekačku
Odpadové vedenie sifónu	Odpadové vedenie udržujte nad povrchom rozsiahle, so správnym sklonom
Blokovanie odpadového potrubia	Vymeňte odpadové vedenie

Netesnosti stĺpca

Možná príčina	Riešenie
Voľná koncovka	Utiahnite koncovú armatúru
Balenie stĺpika v objímke	Demontujte, opláchnite objímku a znova zložte
Nesprávna hrúbka frity	Použite správnu fritu (*)

*Poznámka: Ak je veľkosť častíc stacionárnej fázy 3 až 4 µm, použite fritu 0,5 µm. Ak je veľkosť častíc stacionárnej fázy 5 až 20 µm, použite fritu 2 µm.

Netesnosti detektora

Možná príčina	Riešenie
Porucha tesnenia článku	Zabráňte nadmernému spätnému tlaku alebo vymeňte tesnenie
Prasknuté okienka bunky	Nahradiť okná bunky
Netesné armatúry	Dotiahnite alebo vymeňte armatúry
Zablokované vedenie odpadu	Vymeňte odpadové vedenie
Blokujte prietokovú bunku	Prestavte alebo vymeňte prietokovú celu

---

Problémy s chromatogramom

Mnoho problémov v systéme LC sa javí ako zmeny v chromatograme. Niektoré z nich možno vyriešiť zmenami v prístroji, iné problémy si však vyžadujú úpravu postupu testu. Nastavenie správneho typu kolóny, predkolóna alebo ochrannej kolóny, hadičky, detekčná cela a mobilná fáza sú kľúčom k dobrej chromatografii .

Vrcholový chvost

Možná príčina	Riešenie
Zablokovaná frita	Obráťte preplach kolóny (ak je to povolené) alebo vymeňte fritu (ak je to povolené) alebo vymeňte kolónu
Stĺpec je neplatný	Vyplňte prázdnotu
Rušivý vrchol	Použite dlhšiu kolónu alebo zmeňte mobilnú fázu a/alebo selektivitu kolóny
Nesprávne pH mobilnej fázy	Upravte pH. Pre zásadité zlúčeniny poskytuje nižšie pH zvyčajne symetrickejšie píky
Ukážka reakcie s aktívnymi miestami	Pridajte iónové párové činidlo alebo prchavý základný modifikátor alebo vymeňte kolónu

Peak fronting

Možná príčina	Riešenie
Nízka teplota	Zvýšte teplotu kolóny
Nesprávne rozpúšťadlo vzorky	Na injekčné rozpúšťadlo použite mobilnú fázu
Preťaženie vzorky	Znížte koncentráciu vzorky
Zlý stĺpec	Obráťte preplach kolóny (ak je to povolené) alebo vymeňte vstupnú fritu (ak je to povolené) alebo vymeňte kolónu.

Rozdelené vrcholy

Možná príčina	Riešenie
Kontaminácia na vstupe ochrannej alebo analytickej kolóny	Odstráňte ochranný stĺpec a skúste analýzu. v prípade potreby vymeňte ochranný stĺpik. Ak je analytická kolóna upchatá, obráťte sa a prepláchnite (ak je to povolené). Ak problém pretrváva, kolóna môže byť znečistená silne zadržiavanými kontaminantmi. Použite vhodný postup obnovy (pozri informácie o starostlivosti o stĺpec). Ak problém pretrváva, prívod je pravdepodobne upchatý. Vymeňte fritu alebo vymeňte kolónu.
Vzorka rozpúšťadla nekompatibilná s mobilnou fázou	Vymeňte rozpúšťadlo. vždy, keď je to možné, vstrekujte vzorky v mobilnej fáze.

Skreslenie väčších vrcholov

Maximálne skreslenie môže byť spôsobené preťažením vzorky. Znížte veľkosť vzorky.

Skreslenie skorých vrcholov

Skreslenie skorých eluujúcich píkov môže byť spôsobené nesprávnym vstrekovacím rozpúšťadlom. Znížte objem injekcie alebo použite slabšie injekčné rozpúšťadlo.

Chvost, skoré vrcholy viac ako neskoršie

Možná príčina	Riešenie
Extra-stĺpcové efekty	Prepojte systém (kratšie, užšie hadičky), použite detekčnú celu s menším objemom

Zvýšený chvost so zvyšovaním k'

Možná príčina	Riešenie
Sekundárne retenčné účinky, režim s reverznou fázou	Pridajte trietylamín (základné vzorky) alebo pridajte acetát (kyslé vzorky) alebo pridajte soľ alebo pufor (iónové vzorky) alebo skúste inú kolónu.
Sekundárne retenčné účinky, režim normálnej fázy	Pridajte trietylamín (zásadité zlúčeniny) alebo pridajte kyselinu octovú (kyslé zlúčeniny) alebo pridajte vodu (polyfunkčné zlúčeniny). Len pre metódy normálnej fázy, ktoré používajú rozpúšťadlá miešateľné s vodou. Môžete tiež vyskúšať inú metódu LC.
Sekundárne retenčné účinky, iónovo-párová chromatografia	Pridajte trietylamín (základné vzorky)

Kyslé alebo zásadité vrcholy chvosta

Možná príčina	Riešenie
Nedostatočné ukladanie do vyrovnávacej pamäte	Použite 50 až 100 mM koncentráciu pufra, použite pufor s pKa rovným pH mobilnej fázy

Extra vrcholy

Možná príčina	Riešenie
Vrcholy duchov	Nečistoty vo vzorke, použité činidlá alebo materiál. Zmeňte postup čistenia a/alebo skontrolujte možný zdroj kontaminácie (sklo, liekovky, použité činidlá, rozpúšťadlá atď...)
Neskorý eluujúci pík z predchádzajúcej injekcie	Zvýšte čas chodu alebo sklon sklonu a/alebo zvýšte prietok

Posuny retenčného času

Možná príčina	Riešenie
Slabá regulácia teploty	Použite stĺpový termostat. Ak ho používate, skontrolujte jeho správnu funkčnosť.
Zmena mobilnej fázy	Zabráňte zmenám (vyparovanie, reakcia, atď.)
Slabá ekvilibrácia kolóny	Medzi cyklami nechajte viac času na ekvilibráciu kolóny

Náhle zmeny retenčného času

Možná príčina	Riešenie
Zmena prietoku	Obnovte prietok
Vzduchová bublina v čerpadle	Vypustite vzduch z čerpadla
Nesprávna mobilná fáza	Vymeňte mobilnú fázu za správnu a/alebo nastavte správnu zmes mobilnej fázy na ovládači

Posun základnej čiary

Možná príčina	Riešenie
Kolísanie teploty stĺpca. Aj malé zmeny spôsobujú cyklický rast a pokles základnej línie. Najčastejšie ovplyvňuje index lomu, UV a detektory vodivosti pri vysokej citlivosti	Kontrolujte teplotu kolóny a mobilnej fázy, pred detektorom použite výmenník tepla
Nehomogénna mobilná fáza. Posun základnej línie je zvyčajne spôsobený vyššou absorbanciou, a nie cyklickým vzorom z kolísania teploty.	Používajte rozpúšťadlá, vysoko čisté soli a aditíva HPLC. Mobilnú fázu pred použitím odplynite, počas používania prepláchnite héliom.
Nahromadenie nečistôt alebo vzduchu v detekčnej cele	Prepláchnite celu metanolom alebo iným silným rozpúšťadlom. V prípade potreby vyčistite celu 1N HNO 3 (nikdy nepoužívajte HCl).
Zastrčená zásuvka za detektorom. Vysoký tlak poškodzuje bunkové vetranie a vytvára hlučnú základnú líniu.	Odpojte alebo vymeňte vedenie. Informácie o výmene okna nájdete v príručke k detektoru.
Problém s miešaním mobilnej fázy alebo zmena prietoku	Správne zloženie alebo prietok. Aby ste predišli tomuto problému, pravidelne monitorujte zloženie a prietok.
Pomalá ekvilibrácia kolóny, najmä pri zmene mobilnej fázy	Pred analýzou prepláchnite stredne silným rozpúšťadlom, napustite 10 až 20 objemov kolóny novej mobilnej fázy
Mobilná fáza je kontaminovaná, znehodnotená alebo pripravená z materiálov nízkej kvality	Príprava mobilnej fázy Chack. Používajte chemikálie najvyššej kvality a rozpúšťadlá pre HPLC
Silne zadržané materiály vo vzorke (vysoké k') sa môžu eluovať ako veľmi široké píky a javia sa ako stúpajúca základná línia (analýzy gradientu môžu zhoršiť problém).	Použite ochranný stĺp. Ak je to potrebné, prepláchnite kolónu silným rozpúšťadlom medzi injekciami alebo pravidelne počas analýzy.
Mobilná fáza je recyklovaná, ale detektor nie je nastavený	Obnoviť základnú líniu. Pri prekročení dynamického rozsahu detektora použite novú mobilnú fázu.
Detektor (UV) nie je nastavený na maximum absorbancie, ale na sklon krivky	Zmeňte vlnovú dĺžku na maximum UV absorbcie

Základný hluk (pravidelný)

Možná príčina	Riešenie
Vzduch v mobilnej fáze, detekčná bunka alebo čerpadlo	Odplynenie mobilnej fázy. Preplachovací systém na odstránenie vzduchu z detekčnej bunky alebo čerpadla.
Únik	Pozrite si časť Netesnosti . Skontrolujte, či systém nie je uvoľnený. Skontrolujte, či čerpadlo tesní, nehromadí sa soľ, či nie je nezvyčajný hluk. V prípade potreby vymeňte tesnenia čerpadla.
Neúplné premiešanie mobilnej fázy	Mobilnú fázu premiešajte ručne alebo použite menej viditeľnú vzorku.
Vplyv teploty (stĺpec pri vysokej teplote alebo nevyhrievaný detektor)	Znížte diferenciál alebo pridajte výmenník tepla
Ostatné elektronické zariadenia na tej istej linke	izolujte LC, detektor alebo rekordér/PC, aby ste zistili, či je zdroj problému externý. Opravte podľa potreby.
Pulzácia čerpadla	Začleniť do systému tlmič impulzov.

Základný hluk (nepravidelný)

Možná príčina	Riešenie
Únik	Pozrite si časť Netesnosti . Skontrolujte, či systém nie je uvoľnený. Skontrolujte, či čerpadlo tesní, nehromadí sa soľ, či nie je nezvyčajný hluk. V prípade potreby vymeňte tesnenia čerpadla.
Mobilná fáza je kontaminovaná, znehodnotená alebo pripravená z materiálov nízkej kvality	Skontrolujte prípravu mobilnej fázy
Rozpúšťadlá mobilnej fázy nemiešateľné	Vyberajte a používajte iba miešateľné rozpúšťadlá
Vzduch zachytený v systéme	Prepláchnite systém silným rozpúšťadlom
Vzduchové bubliny v detektore	Detektor čistenia. Za detektorom nainštalujte protitlakové zariadenie
Elektronika detektora/rekordéra	Elektronicky izolujte detektor a záznamník/PC. Ak chcete problém vyriešiť, pozrite si návod na obsluhu.
Detektor je kontaminovaný (aj malé množstvo nečistôt môže spôsobiť hluk)	Vyčistite celu prepláchnutím 1N HNO 3 (nikdy nepoužívajte HCl)
Slabá detektorová lampa	Vymeňte lampu
Kolóna presakuje oxid kremičitý alebo obalový materiál	Vymeňte stĺpec
Nedostatočný alebo nefunkčný mixér mobilnej fázy	Opravte alebo vymeňte mixér alebo mixujte off-line, ak je izokratický.

Široké vrcholy

Možná príčina	Riešenie
Zloženie mobilnej fázy sa zmenilo	Pripravte novú mobilnú fázu
Prietok mobilnej fázy je príliš nízky	Upravte prietok
Netesnosti (najmä medzi kolónou a detektorom)	Pozrite si časť Netesnosti . Skontrolujte, či systém nie je uvoľnený. Skontrolujte, či čerpadlo tesní, nehromadí sa soľ, či nie je nezvyčajný hluk. V prípade potreby vymeňte tesnenia čerpadla.
Nastavenia detektora sú nesprávne	Upravte nastavenia
Koncentrácia pufra je príliš nízka	Zvýšte koncentráciu pufra
Ochranný stĺp je kontaminovaný/opotrebovaný	Vymeňte ochranný stĺpik
Stĺpec je znečistený/opotrebovaný. Nízke registračné číslo.	Vymeňte stĺpec za nový rovnakého typu.
Prázdno na vstupe do kolóny	Otvorte vstupný koniec a vyplňte medzeru alebo vymeňte kolónu
Pík predstavuje dve alebo viac zle rozlíšených zlúčenín	Zmeňte typ stĺpca, aby ste zlepšili separáciu
Teplota kolóny je príliš nízka	Zvýšte teplotu. Neprekračujte 60°C, pokiaľ vyššie teploty nie sú prijateľné pre výrobcu kolóny.
Časová konštanta detektora je príliš veľká	Použite menšiu časovú konštantu

Široké vrcholy môžu byť spôsobené efektmi mimo stĺpca:

• Kolóna je preťažená - vstreknite menší objem (napr. 10 µl namiesto 100 µl) alebo zriedte vzorku
• Čas odozvy detektora alebo príliš veľký objem bunky – skráťte čas odozvy alebo použite menšiu bunku
• Hadička medzi kolónou a detektorom je príliš dlhá, vnútorný priemer je príliš veľký – použite čo najkratší kus hadičky s vnútorným priemerom 0,007" až 0,010" (UHPLC techniky vyžadujú použitie hadičky s vnútorným priemerom 0,005")
• Čas odozvy rekordéra je príliš vysoký – Skráťte čas odozvy

Strata rozlíšenia

Možná príčina	Riešenie
Mobilná fáza je kontaminovaná (znehodnotená (spôsobuje zmenu retenčného času)	Pripravte novú mobilnú fázu
Upchatá ochranná alebo analytická kolóna	Odstráňte ochranný stĺpec a vykonajte analýzu. V prípade potreby vymeňte kryt. Ak je analytická kolóna upchatá, otočte ju a prepláchnite. Ak problém pretrváva, kolóna môže byť znečistená silne zadržiavanými kontaminantmi. Použite vhodný postup obnovy podľa návodu výrobcu. Ak problém pretrváva, prívod je pravdepodobne upchatý. Vymeňte fritu alebo vymeňte kolónu.

Všetky vrcholy sú príliš malé

Možná príčina	Riešenie
Útlm detektora je príliš vysoký	Znížte útlm
Časová konštanta detektora je príliš veľká	Použite menšiu časovú konštantu
Veľkosť injekcie je príliš malá	Zvýšte koncentráciu vzorky alebo zvýšte vstrekovací objem, ak to veľkosť kolóny umožňuje
Nesprávne pripojenie rekordéra	Použite správne pripojenie

Všetky vrcholy sú príliš veľké

Možná príčina	Riešenie
Útlm detektora je príliš nízky	Použite väčší útlm
Veľkosť injekcie je príliš veľká	Znížte koncentráciu vzorky alebo znížte vstrekovací objem, použite menšiu vzorkovú slučku alebo použite čiastočné plnenie slučky
Nesprávne pripojenie rekordéra	Použite správne pripojenie

---

Problémy s injektorom

Manuálny vstrekovač, ťažko sa otáča

Možná príčina	Riešenie
Poškodené tesnenie rotora	Prerobte alebo vymeňte tesnenie/ventil
Príliš tesný rotor	Upravte napnutie rotora

Manuálny vstrekovač, ťažko sa napĺňa

Možná príčina	Riešenie
Nesprávne nastavený ventil	Upravte zarovnanie
Blokovaná slučka	Vymeňte slučku
Špinavá injekčná striekačka	Vyčistite alebo vymeňte injekčnú striekačku
Zablokované linky	Vyčistite alebo vymeňte riadky

Injektor automatického odberu vzoriek – neotáča sa

Možná príčina	Riešenie
Žiadny tlak vzduchu alebo výkon	Dodajte správny tlak/výkon
Príliš tesný rotor	Upraviť
Nesprávne nastavený ventil	Upravte zarovnanie

Autosampler - iné problémy

Možná príčina	Riešenie
Blokovanie	Vyčistite alebo vymeňte zablokovanú časť
Zaseknutý mechanizmus	Pozrite si servisnú príručku
Chybný ovládač	Opravte alebo vymeňte ovládač

---

Problémy zistené čuchom, zrakom alebo zvukom

Zápach rozpúšťadla

Možná príčina	Riešenie
Únik	Pozrite si časť Netesnosti
vyliať	Skontrolujte, či nepreteká nádoba na odpad alebo nájdite rozliatu a vyčistite ju

"Horúca" vôňa

Možná príčina	Riešenie
Modul prehrievania	Skontrolujte správne vetranie, upravte ho alebo skontrolujte nastavenie teploty, nastavte alebo vypnite modul, pozrite si servisnú príručku

Abnormálne údaje z merača

Možná príčina	Riešenie
Abnormality tlaku	Pozrite si časť Abnormálny tlak
Problém so stĺpovou rúrou	Skontrolujte nastavenia a upravte ich, pozrite si servisnú príručku
Detektorová lampa zlyhá	Vymeňte lampu

Výstražné svetlá

Možná príčina	Riešenie
Prekročený tlakový limit	Skontrolujte zablokovanie alebo skontrolujte nastavenia limitov a upravte ich
Ďalšie výstražné kontrolky	Pozrite si návod na obsluhu/servis

Výstražné bzučiaky

Možná príčina	Riešenie
Únik/rozliatie rozpúšťadla	Nájdite a opravte
Ďalšie varovné bzučiaky	Pozrite si návod na obsluhu/servis

Vŕzganie a škrípanie

Možná príčina	Riešenie
Porucha ložiska	Pozrite si servisnú príručku
Slabé mazanie	Namažte podľa potreby
Mechanické opotrebovanie	Pozrite si servisnú príručku